質問： ハイスループットスクリーニング（HTS）用のオルガノイドはどのように調整するのですか？
答: オルガノイドは、ハイドロゲル/マトリゲルで多細胞構造として培養および維持され、機械的に剪断して断片に分割し、ウェルあたり約 300 個のオルガノイド断片(構造あたり5〜20細胞)で播種する必要があります。しかし、これはオルガノイドの種類や、アッセイの時間枠内でオルガノイドがどれだけ速く増殖するかによって異なります。
全体として、オルガノイドを 384 ウェルプレートに播種し、化合物を個々のウェルに添加し、5日間培養します。エンドポイントのリードアウト値はさまざまですが、例えば「腫瘍の死滅」に関心がある場合、リードアウト値はCTGリードアウト値かハイコンテンツイメージング（HCI）になる可能性があります。Crown Bioscience では、凍結保存された "アッセイレディ"オルガノイドと特定のオルガノイドパネル用にあらかじめ確立された最適な条件で効率的に細胞を播種する高度なリキッドハンドリングロボットを組み合わせて使用します。これにより、1日に大量のプレートを播種し、複数の化合物をスクリーニングすることが可能になり、HTSにオルガノイドを使用することが容易になります。
質問： 3D モデルにおけるハイコンテンツイメージング(HCI)は、従来のアプローチやリードアウトとどのように比較するのですか?
答: in vitro 3D モデルには、従来の 2D 単層培養では起こらない実質的な細胞間の相互作用があるため、測定できるパラメータはさらに多くなります。HCIとハイコンテンツ分析（HCA）は、複数の表現型や形態学的エンドポイントを同時にモニターできるマルチプレックス技術を使用しているため、特定の化合物の 3D バイオロジーやメカニズムについて、より深い洞察を可能にします。
- 核の数、大きさ、容積、形状
- ネクローシスとアポトーシスマーカー
- 上皮の形成と厚さ
- 極性と腫脹
- 内部移行
- 細胞周期
- 治療法／標的ローカライゼーション
- 腫瘍細胞、免疫細胞、線維芽細胞のモニタリング（共培養アッセイにおいて）
これらのパラメータは、IC50 および曲線下面積(AUC)値を生成するすべての異なる投与量で観察されます。ハイコンテンツスクリーニング(HCS)には、自動化された画像ベースのハイスループット技術と、HCI データにマルチパラメータアルゴリズムを適用する HCA が含まれるため、完全なz-スタック分析結果(> 300 の異なる形態学的特徴)を単一のウェルでアッセイできます。これにより、特にOMIC分析と組み合わせた場合に、意思決定をより適切に導くことができる洞察に満ちたデータが豊富に得られます。
質問：バイオマーカー分析に必要な細胞株やオルガノイドの数を教えてください？
答:答：留意すべき重要な点は、効果的なバイオマーカー探索には、有効性に十分な広がりがあり、バイアスのリスクを最小化するために、レスポンダーとノンレスポンダーの数が均衡している必要があるということです。
in vitro 細胞株スクリーニングでは、通常、少なくとも10株の感受性細胞株と 10株の非感受性細胞株を用意することを推奨しますが、感受性細胞と非感受性細胞の間には十分な有効性の差、例えばIC50値に10倍の差がなければなりません。これは利用可能なモデルが豊富な一部のがん種では実現可能ですが、希少がん種や特定の亜型では、十分な広がりを確保することがより困難な例もあります。
質問：外部の in vitro や in vivo のスクリーニングデータをバイオマーカー探索のために考慮することは可能ですか？
答: はい可能です。サンプルサイズが統計的検定を実施するのに十分であれば、バイオマーカー探索のための前臨床結果に基づくデータセットを受け入れます。たとえば、Crown Bioscience で複数のモデルをテストし、別の研究所で別々にテストした場合、実験データセットが同様の実験設定を共有していれば、実験データセットを標準化してマージできます。
質問：オルガノイドと PDX のペアモデルに関する情報を提供するデータベースはどれですか?
答: Crown BioscienceのOrganoidBase™には、PDX 由来オルガノイド(PDXO)と患者由来オルガノイド(PDO)の両方があります。 現在、このデータベースには400以上の PDXO が含まれており、Crown Bioscience のHuBase™ データベースに掲載されている対応する in vivo PDX モデルがあります。お客様は、一方または両方のデータベースへのアクセスを登録できます。
モデルは、がんのタイプ別にリストアップされ、一致する in vivo モデルを簡単に識別できるように、同一の名称を共有しています。 OrganoidBase™ には、創薬で広く使用されている in vitro と in vivo の一致したペア間のゲノム、組織学的、薬理学的な相関関係など、患者と PDX の一致した特徴も記載されています。
質問：オルガノイドを使ってプロテオミクス研究を行うことは可能ですか？
答: もちろん可能です。 Crown Bioscience はこのテーマで学会ポスターを発表しました。その研究では、肺がんと大腸がんのオルガノイドを、同等の in vivo PDX モデルと比較しました。具体的には、オルガノイドと PDX 両方の標的薬剤に対する治療応答を説明し、下流の標的経路（例えば、Ras、EGFR、RET シグナル伝達）と機能的プロテオーム、リン酸化タンパク質およびキナーゼ濃縮への影響を評価しました。
質問：プライマリー細胞はどのようにスクリーニングされるのですか、また、どちらも患者の腫瘍に由来する場合、オルガノイドとどのように比較するのですか？
答: プライマリー細胞は2D細胞株と同様の方法で取り扱われるため、薬物スクリーニングの目的に適しています。 PDX、PDXO、および PDX 由来細胞株(PDXC)を患者サンプルおよび標準2D細胞株と比較したトランスクリプトミクス解析では、PDX および PDXO は PDXC よりも患者サンプルとの類似性が高いことが示されましたが、2D 細胞株は最も類似していないことが判明しました。これは主に、2D 細胞株がプラスチック表面での増殖に適応したことに起因しています。その結果、3Dまたは in vivo 環境で通常観察される細胞間または細胞とマトリックスの相互作用が失われます。さらに、一部のがん種からプライマリー細胞を誘導することは依然として困難であることが知られており、典型的な培養条件では、in vitro 環境に最も耐えられる細胞が選択されることがよくあります。
質問： Crown Bioscience が使用している細胞株やオルガノイドのゲノムデータの情報源は何ですか？
答: OmniScreenTM および OrganoidXploreTM パネルに含まれるものを含め、Crown Bioscience が使用するほぼすべての細胞株およびオルガノイドについて、全トランスクリプトームシーケンスおよび全エクソームシーケンスが社内で実施され、遺伝子発現、変異状態、DNAコピー数に関する情報が提供されています。社内でシーケンスされていない株については、当社の科学者が Cancer Cell Line encyclopedia のようなデータベースから一般に入手可能な発現、変異、コピー数のデータをまとめました。これらのデータはすべて検索可能なデータベースで利用可能であり、データは標準化、正規化され、比較目的に使用することができます。
質問：オルガノイドはいずれ 2D 細胞株に取って代わるのでしょうか、それとも 2D と 3D モデルは互いに補完し合えるのでしょうか？
答: 利用可能なオルガノイドの範囲は急速に拡大しています。これによって研究者は、HTS、遺伝子工学、共培養研究など、従来は2D細胞株に依存していた多くの用途に使用できる、臨床的予測性の高いモデルをより多く選択できるようになりました。3D in vitro オルガノイドは、複雑な in vivo の環境をより忠実に再現しているため、オルガノイドを用いることでがん創薬を改善し、加速することができ、状況によっては細胞株に取って代わる可能性もあります。例えば、健康なオルガノイドと病気のオルガノイドを並べて比較することができます（オンターゲット／オフターゲット効果に関する知見が得られます）。
2D モデルと 3D モデルは確実に補完し合うことができます。2D細胞株は、仮説検証のために大規模なデータセットを迅速に作成するためにしばしば使用され、これをオルガノイドのような臨床的により関連性の高い3Dモデルでさらに検証することでフォローアップすることができます。
質問：バイオマーカー探索に関して、オルガノイドのような3Dモデルと 2D モデルの違いは何ですか？
答: 3D in vitro オルガノイドは、2D細胞株モデルよりも、複雑な in vivo 環境、患者の遺伝的多様性、薬理学的応答をより忠実に再現します。3D オルガノイドと HCI を組み合わせることで、より多くの表現型の特徴を同定することができるため、研究者は、有効性のモニタリングや患者の層別化に使用できるバイオマーカーとして適していると思われる関連した特徴を同定できる可能性が高くなります。
質問： 3D in vitro モデルは、臨床における患者の層別化に役立ちますか？
答: 早期発見時に患者由来のモデルを使用することは、バイオマーカーの同定に大きな可能性を秘めています。複数の患者関連モデルで化合物の配列をスクリーニングすると、レスポンダーとノンレスポンダーの両方について貴重なデータが生成されます。この情報は、どの患者がどの薬剤に最も応答するかを区別できるバイオマーカーを同定するのに役立ちます。
これを効果的に行うには、必要なインフラストラクチャと経験を備えた包括的なアプローチが必要です。全体として、十分な数のモデルをスクリーニングし、必要なバイオアナリシス、HCI、およびバイオインフォマティクスを組み合わせて、データが有意義で実用的なものになるようにする必要があります。これは、腫瘍と免疫細胞の相互作用をモデル化するのが複雑な免疫療法にとって特に重要です。したがって、ex vivo 患者組織プラットフォームなど、他のモデルシステムにおける追加の最適化、検証、および定量化が必要になる場合があります。
質問： CAR-T のような自己T細胞療法を評価するために、免疫微小環境と組み合わせて PDO を使用した経験について教えてください。CAR-T の生成とオルガノイド内の免疫系の再構成に同じドナー／患者を使用するのでしょうか？
答: 私たちの標準的なやり方では、CAR の特定の標的を発現する、確立されたオルガノイドモデルを用いて非自己T細胞療法を試験します。しかし、自己細胞システムを確立するためには、新しいオルガノイドモデルを生成し、同じドナー／患者を使って CAR-T を生成する必要があります。別のアプローチとしては、アッセイ中、未変化の自己 TME が in situ に存在する ex vivo 組織を用いることが考えられます。
質問： PDXO と PDO は密接にマッチしていますか？
答: PDXO と PDO は、それぞれの由来組織と極めて高い相関性があります。 私たちは PLOS ONE 誌で、PDXO と PDX の間に高い相関性があることを示しました。患者組織を使って PDO と PDX の両方を生成し、その後にPDXOを生成した例は多くはありませんが、これが行われた場合、非常に高い相関関係があります。これらはすべて共通の常在成人幹細胞に由来するため、驚くべきことではありません。Current Protocols に掲載された私たちの論文は、この点を説明する例を示しています。
質問：細胞株の薬剤感受性を評価するためのデータベースで推奨するものはありますか？
答: Crown Bioscience の XenoBaseTM データベースは、in vitro と in vivo の両方の細胞株における薬物応答に関する情報を提供しています。すべての細胞株のデータを表示するには、上部にある in vitro フィルターが選択されていることを確認してください。これが完了すると、利用可能なパネルから個々の細胞株を選択できます。
質問：単一モデル由来のドナープールを生成するのですか、それとも、これらのドナーは別々に保管され、スクリーニングの際にN数として使用されるのですか？
答: ドナープールは生成しません。むしろ、私たちの各モデルは一人の患者に由来し、あたかも一人の患者であるかのようにスクリーニングされます。モデル内で観察される変動はすべて、その特定のサンプル／患者内の固有の異質性によるものです。したがって、スクリーニングのモデル数を増やすことで、患者集団全体に存在する不均一性を反映した、より広範な多様性を捉えることができます。
質問：オルガノイドには、さまざまなTME細胞がどの程度表現されていますか? がん関連線維芽細胞はオルガノイドで研究できますか?
答: オルガノイドは純粋な上皮区画で構成されているため、オルガノイド培養にはTME細胞は存在しません。しかし、オルガノイドは線維芽細胞や免疫細胞と容易に共培養でき、異なる細胞タイプ間の相互作用や治療応答への影響を研究できます。
質問：オルガノイドの開発に PDX を使う場合、選択圧はありますか？
A: はい、さまざまな選択圧があります。侵襲性の高い腫瘍は、免疫不全マウスに移植すると成功率が高くなる傾向がありますが、オルガノイド培養系は正常組織と腫瘍組織の両方に対応します。その結果、PDX 由来のオルガノイドは、より侵襲性の腫瘍特性を示すことになります。さらに、PDX モデルでは、腫瘍微小環境(TME)はマウスの宿主要素で構成されており、ヒト間質細胞がマウスの対応する細胞に置き換わります。
質問：動物モデルの「継代」プロセスよりPDOを使用する利点がどこにありますか？
答: PDO は腫瘍悪性度と正常組織の幅広い範囲を提供します。対照的に、患者由来異種移植オルガノイド（PDXO）は、同じ患者由来の十分に特性化された in vivo PDX モデルによって補完され、がんの各適応症の大規模なオルガノイドコホートの生成を可能にします。
質問：患者サンプルからオルガノイド培養を確立する場合、通常、どの程度の効率が見られますか？
答: 効率は組織の種類に依存し、一部のタイプは他のタイプよりも確立が容易です。しかし、これは特定の組織タイプに使用される経験や培養条件にも依存します。Crown Bioscience は、Hans Clever博士の研究室が開発した一連のオリジナルプロトコルに基づいて最適化された HUB プロトコルを使用しています。これらのプロトコルは、さまざまな組織タイプ(正常組織と疾患組織の両方)にうまく適応しており、世界中の研究室で広く使用されています。
質問：3D オルガノイドでは、免疫チェックポイント阻害剤の研究は可能ですか？
答: もちろん可能です。免疫チェックポイント阻害剤は、自己免疫細胞を用いたオルガノイド共培養に最適です。私たちは、非自家共培養を使用した場合に起こり得るアロ反応性応答がない場合に免疫チェックポイント阻害剤を特異的に評価するために、このようなシステムを確立しました。ただし、すべてのモデルが自己免疫細胞と一致しているわけではない点に留意し、研究を計画する前に当社の専門家と話し合ってください。
質問：2D 細胞培養で有効性が示された化合物があります。それを 3D モデルで試験するにはどうすればよいでしょうか？
答:使用された標的細胞株に応じて、当社の科学者はお客様と協力して、関連する3D培養アッセイを設計したり、化合物をスクリーニングするためのオルガノイドパネルを選択します。
質問：オルガノイドにはどの細胞生存率アッセイを使用していますか?
答: 通常、CTG または HCI でオルガノイドの細胞生存率を測定します。
質問：スフェロイドの経験は豊富ですが、現在、オルガノイドの使用を検討しています。始める前に読んでおくことを推奨する研究論文はありますか？
答: 答：オルガノイドがあなたの研究をどのようにサポートできるかを探っておられるのは素晴らしいことです。Hans Clever博士の研究室からは、良いスタートとなる古典的な出版物がいくつかあります。また、PLOS ONE、 Current Protocols、 JOVE などの出版物に掲載された私たちの査読付き論文や、多くの学会ポスター発表、オンデマンドウェビナー、ホワイトペーパーなどをお勧めします。これらはすべて、 当社のリソースページで簡単に見つけることができます。
質問：栄養供給を強化するために、オルガノイド内に毛細血管様構造を発達させることは実現可能ですか？
答: 特定の in vitro モデルに毛細血管様構造を導入した研究が報告されていることは承知していますが、私たちはそのようなプロトコルはテストしていません。私たちの標準的なプロトコル（展開と実験作業の両方）は、オルガノイドの最大サイズを〜120μmに維持するように最適化されています。これにより、より大きな構造で起こりうる栄養／成長因子の浸透の問題を防ぐことができます。成長の速いモデルや、もともと大きな構造体では、ある一定の大きさを超えると、コアの成長が低下したり、細胞死が起こったりすることがあります。このことは、過剰なオルガノイドの成長を制限し、より小さな構造として維持する必要性を力説しています。
質問：レスポンダーとノンレスポンダーを同定する場合、2D 細胞株と 3D オルガノイドモデルの出力類似性はありますか？
答:これは、薬剤やそのモデルの標的/発がんドライバーによって異なります。しかし、オルガノイド（およびPDX）のような患者由来モデルとは異なり、トランスクリプトーム解析により、2D細胞株は、主に数回（または多数回）の継代に渡る in vitro 増殖条件への適応により、臨床反応の予測性が低い傾向があるため、理想的なヒト関連腫瘍モデルではないことが実証されています。
